精子DNA碎片指数与精液参数的相关性研究

【摘要】目的：探讨男性精子DNA碎片与精液常规参数及精子顶体酶活性之间的关系。方法：收集生殖中心门诊553例男性患者精液标本，采用改良精子染色质扩散实验（SCD）检测精子DNA碎片指数（DFI），按精子DFI结果分为DFI<15%（I组）、15%≤DFI<25%（II组）、DFI≥25%（III组），同时检测精子密度、总数、（a+b）级精子百分率、畸形率及顶体酶活性，对DFI与精液各项参数的相关性进行分析。结果：精子密度及精子总数与DFI无显著相关性；前向运动精子百分率随DFI升高逐渐降低，III组与I组间存在显著性差异；精子正常形态率随DFI的增加有下降的趋势，但是差异不显著；精子顶体酶活性随DFI升高而降低，组间均有显著性差异。结论：精子DNA碎片指数与前向精子百分率及精子顶体酶活性呈负相关。因此DFI可作为评估精子功能的一个较好的参考指标。

【关键词】精子；DNA碎片；精液参数

【中图分类号】R167【文献标志码】A

以往，对于男性不育的诊断主要参考精液的密度、活动率及精子形态等指标。这些参数只能解决精子质量和功能的小部分问题，而对于评判精液的受精能力的作用相对较低[1]。随着细胞生物学及分子生物学的发展，人们逐渐将关注的重点转移到了精子的染色体上，并提出了精子DNA碎片（DNA fragmentation）的概念。曾有研究者提出在射出的精液中精子的DNA碎片率在10%～20%，且无论精液常规异常与否，都有可能存在较高的精子DNA碎片率[2]。本研究采用精子染色质扩散实验（Sperm Chromatin Dispersion，SCD）的方法检测精液标本的精子DNA碎片率，分析其与精子密度、精子活动率、精子形态及精子顶体酶之间的关系。

1材料与方法

1.1研究对象

选择2012年9月1日至2012年12月31日在解放军第一八一医院生殖中心就诊的553例男性作为研究对象，年龄在24～41岁，所有患者禁欲3～7d，手淫方法收集精液标本，在36℃温箱放置15～30min待其完全液化。

1.2方法

取已液化的精液10μL于精子计数板（Makler counting chamber，以色列，Sefi-medical Instruments）进行镜下观察，记录精子密度，前向运动精子（a+b级）百分率；采用Diff-quick法进行标本染色，在100×油镜下观察；精子顶体酶活性使用深圳华康生物医学工程有限公司精子顶体酶活性定量检测试剂盒（改良Kennedy法）进行检测；精子DNA碎片使用深圳博锐德生物科技有限公司SpermFunc DNAf精子DNA碎片检测试剂盒（SCD法）进行检测。按照WHO《人类精液检查与处理实验室手册》（第5版）将25%定为精子DNA损伤的正常临界值。本研究将553份精液标本分为3组。I组：精子DNA碎片偏低组（DFI<15%）；II组：精子DNA碎片偏高组（15%≤DFI<25%）；III组：精子DNA碎片异常组（DFI≥25%）。将3组精液的精子密度、总数、（a+b）级精子百分率、畸形率及顶体酶活性进行比较分析。

1.3统计学分析

使用SPSS 17.0统计软件对结果进行分析。

3讨论

精子染色质不论是在组成还是在结构上都与体细胞有很大不同。替代组蛋白成为精核蛋白的鱼精蛋白（HP）和大量的二硫键使精子染色体高度浓缩，这种特化的结构可以保护精子DNA免受伤害，因此成熟精子对各种致病因素有较强的抵抗力。DNA修复发生在精子生成过程中，当完成DNA的转录及翻译而形成精子后，DNA的修复就已完成[3]。

精子DNA碎片有可能来源于生精过程和后生精过程[4]。在正常的精子发生过程中，染色质的组装需要内源性核酶（拓扑异构酶Ⅱ）参与，以建立和连接DNA缺口，有助于组蛋白被鱼精蛋白替换过程中释放扭力（torsional stress）和染色质重组[5]。各种原因导致的精子鱼精蛋白含量降低，二硫键形成障碍，均可能导致染色体浓缩异常，进而导致DNA出现碎片化。精子生成后，在男性生殖道的储存及运输过程中，过高的白细胞可刺激人类精子产生活性氧（ROS）类物质。这种刺激可以通过细胞-细胞接触或白细胞产生的可溶性产物等多种途径介导[6]，也可能是白细胞通过瀑布样机制增加精子的原发性DNA损伤，并诱发潜在DNA损伤，在形态差、活力低的精子中尤其如此[7]。部分疾病在发病过程中也可以出现精子DNA的损伤。精索静脉曲张的不育患者表现出明显的精子DNA损伤。DNA碎片的增高可能是由于迂曲扩张的精索静脉血管使睾丸、附睾等局部血液回流速度变慢，长期以后则对睾丸和附睾的微循环系统形成潜在的影响，血-睾丸和血-附睾屏障功能受损，使局部代谢产物输送和交换速度下降，生精细胞的生长发育受到抑制或破坏，造成精子DNA损伤[8]。另外，一些微量元素的缺乏（如硒[9]、锌[10]等）或过多的接触某些化学品（如丙烯腈[11]、苯并芘[12]、甲苯[13]）都可导致精子DNA碎片的增加。

SCD法是根据酸变性和去核蛋白后DNA扩散是否形成特征性光晕，进而区分精子DNA损伤程度。正常情况下，如果精子DNA未发生断裂，精子核染色质无法通过核膜扩散出来，因此在酸分解精子核膜后，完整的精子DNA才能扩散出来，在染色剂的作用下形成较大的光晕。而存在DNA碎片的精子由于部分或全部核物质在酸处理前就已经扩散到精子核膜外部，因而在染色后就无法产生较大的光晕或者无光晕[14]。有证据表明，传统的精液分析结果与精子DNA损伤的程度之间关系不大，因此，即使一份精液是“正常的”，它也可能存在很高的DNA碎片[15]。因此，精子DNA的角色并不单单在于受精，更重要的是精子DNA会将来自父方的遗传物质带给后代，可能会造成子代肿瘤以及不育等[16]。本中心的研究显示，精子DNA碎片率与前向活动精子百分率呈显著负相关，提示DNA损伤可能是导致弱精子症的重要原因之一。因为精子核DNA的损伤与线粒体功能密切相关，DNA损伤严重的精子其线粒体呼吸代谢功能明显降低，精子活力也随之减弱[17]。另外，本研究的结果还显示在不同精子DNA碎片组之间，正常形态精子百分率差异虽然不明显，但是随着精子DNA碎片率的升高，正常精子百分率有下降的趋势。有研究证实，精子DNA碎片与精子核鱼精蛋白含量及精子正常形态率呈显著负相关。且鱼精蛋白1与鱼精蛋白2比值的下降可显著增加精子DNA碎片率，但鱼精蛋白2缺乏时精子的正常形态率将显著降低[18]。除了精液常规参数外，精子顶体酶活性也与精子的受精能力密切相关。精子顶体酶是以酶原形式合成并储存在顶体内的，其作用类似于胰蛋白酶，它能水解卵透明带糖蛋白，使精子穿过卵丘再穿过透明带而进入卵子完成受精。由于精子遗传物质受到破坏，可能影响相应蛋白的转录或合成，从而影响顶体酶原的生成，或者由于无法合成某种酶原激活物质，使顶体酶无法被激活，最终表现为顶体酶活性降低[19]。本研究的结果也显示精子顶体酶活性呈明显负相关。这些结果与国外一些研究结果相似[20-22]。当然，也有一些研究表明，DNA碎片与精液参数无明显相关性[23]。这有可能与选择的标本类型、样本量及检测方法有关。因此，在进行不孕症调查过程中，精子DNA碎片的检测可作为男性精液常规参数分析的一种补充，对于全面评估男性生育力是很有意义的。

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（收稿日期：2013-12-02）